GSN抑制肝癌细胞凋亡并促进肝癌细胞浸润转移的研究

【摘要】全国第三次死因抽样调查的统计显示，2004-2005两年广西9个抽样点的居民恶性肿瘤死亡率为112.02/10万，位于全部死亡原因的第一位。广西恶性肿瘤死亡率已由九十年初38.29／10万上升到近三年112.02/10万,上升幅度居全国首位。其中，肝癌位于广西所有恶性肿瘤死亡的第一位，可见，肝癌是广西第一位癌症杀手。原发性肝细胞癌（HCC）早期一般无任何症状，一旦出现临床表现，病情大多已进入中、晚期，而且恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强。目前肝癌的发现和诊断是通过血清AFP检测结合影像学检查。但仅依靠血清AFP浓度来诊断肝癌，灵敏度为39%-64%之间，特异度为76%-91%，阳性预测值只在9%-32%，这就使得很多肝癌患者漏检，或假阳性和假阴性，直接影响肝癌患者的诊断和治疗。因此，寻找有效的肝癌标志物用于提高肝癌的检出率及高危人群的筛查和预警，成为广西地区肝癌研究的当务之急。同位素标记相对和绝对定量（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ）技术是近年来开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，结合MALDI-TOF-TOF串联质谱可对血清、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究，是一种理想的寻找生物标记的技术。本课题组在前两个国家自然科学基金项目的支持下，利用iTRAQ标记结合LC-MALDI-TOF/TOF串联质谱技术，分析和鉴定配对的乙肝相关的HCC、乙肝肝硬化、慢性乙肝及正常对照各30例血清中的差异表达蛋白，统计分析发现：肝癌与正常对照组比较，共发现98个差异表达蛋白，按AFP值分组统计，在AFP>400ng/ml组筛出差异蛋白总52个，在肝癌组表达上调的差异蛋白有36个，下调16个；在400ng/ml>AFP>25ng/ml组筛出的差异蛋白34个，在肝癌组表达上调20个，下调14个；在AFP<25ng/ml组筛出差异蛋白32个，在肝癌组表达上调为21个，下调为11个；其中凝溶胶蛋白gelsolin(GSN)的表达水平在上述三组肝癌中的表达水平均明显下降，且GSN与肝癌的相关文献报道很少，GSN会不会是肝癌的重要标志物？这引起了我们极大地兴趣。生物标志物的发现必须经过发现或鉴定（Discovery），验证（Verification），确认（Validation）三个步骤，而后才进入临床检验和分子流行病学现场应用等更深入的阶段。从发现→验证→确认→应用每一步的深入均意味着时间、样本数量、投入成本等的不断增加，而目前绝大部分的标志物的研究均终止于验证阶段，真正能进入应用的标志物很少。这其中的重要原因是由于人类肿瘤基因的不稳定性、异质性等复杂因素的影响，在血清蛋白组发现的差异表达蛋白中，既含有肿瘤形成所必需的关键性改变,也含有仅仅因肿瘤基因组的不稳定性而产生的伴随性改变。因此，如何将那些影响肿瘤发生发展的关键性分子改变从伴随性改变中识别出来，成为可靠肝癌血清标志物并确定其在肝癌发生发展中起到关键性作用，是肝癌分子流行病领域分子标志物研究面临的重要挑战。本课题组前期通过定量血清白蛋白组学研究，已经提示GSN是肝癌血清的潜在标志物，本研究重点要回答GSN是否在肝癌发生发展中起到关键性作用这个问题，为此采用如下策略：（1）转录组策略，通过构建GSN沉默/过表达肝癌细胞株，采用高通量测序方法（RNA-seq）研究GSN影响的肝癌细胞转录调控，分析差异基因表达及其功能，探讨GSN引起的肝癌细胞生物学效应的重要线索，并进行功能验证。（2）临床相关分析策略，分析GSN表达水平变化与临床病理之间的关系，获得GSN引起的肝癌细胞生物学效应的重要线索，进一步进行功能验证并阐明其可能机制。第一部分构建GSN沉默/过表达稳定转染肝癌细胞株目的：构建GSN沉默/过表达细胞及其空载对照肝癌细胞，进行基因和蛋白水平的验证并筛选稳定转染细胞系，为后续研究提供良好细胞模型。方法：1.采用慢病毒表达载体，构建GSN过表达肝癌细胞GSN-SMMC7721和空载对照NC1-SMMC7721稳定转染细胞株。首先将慢病毒质粒PCDH-CMV-MCS-EFl-PuroGSN以及PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro空载对照质粒分别与辅助质粒psPAX2，pMD2.G，按照4：3：1混合，与转染试剂一起滴加到293T细胞中，转染48小时后收集病毒液并感染SMMC7721肝癌细胞，共孵育48小时后加入含1ug/ml的嘌呤霉素筛选。2.采用真核表达载体构建GSN沉默肝癌细胞GSNshRNA-SMMC7721和空载对照NC2-SMMC7721稳定转染细胞株，将pGFP-V-RSGSNshRNA质粒及空载对照质粒pGFP-V-RSshRNA转染SMMC7721细胞，24小时后观察绿色荧光信号，待绿色荧光信号不再增加时加入1ug/ml的嘌呤霉素筛选。3.RT-PCR和In-cellWB(In-cellwesternblotting)检测GSN-SMMC7721、NC1-SMMC7721、GSNshRNA-SMMC7721和NC2-SMMC7721中的GSN表达，对转染细胞系进行GSN表达水平的验证。4．In-cellWB对传5代、10代、20代的转染细胞系进行GSN表达水平检测，确认稳定转染细胞系的建立。结果：1．在过表达/沉默肝癌细胞中，RT-PCR的检测结果表明，GSNmRNA在转染细胞中上调达对照水平的6.982±1.614(P=0.000)，下调表达水平为对照水平的0.364±0.025（P=0.001）。In-cellWB的检测结果表明，GSN蛋白表达上调达对照水平的2.022±0.179(P=0.000)，下调表达水平为对照的0.233±0.052（P=0.000）。2．采用1ug/ml嘌呤霉素筛选GSN沉默/过表达肝癌细胞5代、10代、20代后，In-cellWB的检测结果表明，转染细胞中GSN表达水平稳定且与预期相符。结论：成功构建了GSN沉默/过表达稳定转染肝癌细胞株，可作为下一步探讨GSN在肝癌中的生物学效应研究的细胞模型。第二部分GSN过表达肝癌细胞的转录组学研究目的：利用高通量测序方法（RNA-seq）研究GSN影响的肝癌细胞转录调控，分析差异基因表达，对差异表达基因进行聚类和功能分析，为进一步探讨GSN的功能提供有价值的线索。方法：1．提取细胞总RNA，分离纯化mRNA,利用RNA-seq技术对GSN过表达细胞GSN-SMMC7721及其亲本SMMC7721进行转录组测序和差异基因表达分析。收集Ionproton高通量测序仪得到的原始数据，将它们与基因组序列比对，寻找基因注释信息。2．构建Junction数据集，根据UCSC的refGene.txt文件作为基本的基因注释文件，统计出落在每个基因区间内的序列个数并进行校正，用FPKM（fragmentsperkilobaseofexonpermillionfragmentsmapped）值代替序列个数，用每个基因的序列个数，除以相应基因的长度，再除以该样本唯一比对到基因组上的序列总数，最后乘以109，将数据呈到GEO(GeneExpressionOmnibus)比对，统计出基因表达丰度、可变剪接类型、新基因等表达结果。3.对GSN-SMMC7721及亲本SMMC7721细胞株中表达的基因,按照它们在GO(GeneOntology)上的功能分类进行总体的比较；利用IDEG6软件对相同基因在不同样本中的表达量,根据AudicandClaverietest;Fisherexacttest;chi-suqaredtest统计检验,找到差异有统计学意义的基因；进一步挑出RPKM>2且差异倍数大于等于50倍的基因,利用WEGO在线分析工具,对其进行功能聚类；对富集的基因在KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)服务器上进行生物学通路分析,研究其在具体通路中所处的地位和作用以及在细胞株中的表达差异。4.根据差异基因集聚的功能分类和KEGG通路筛选GSN可能影响的肝癌转录调控,分析可能的机制。结果：1.Ionproton高通量测序仪得到的原始数据共含有约7.5G的碱基,含78,119,422个片段,每个片段的平均长度约为100bp。2.通过FPKM值获取基因表达丰度信息,将FPKM>2的基因纳入统计范围,对GSN过表达细胞GSN-SMMC7721及其亲本SMMC7721的全转录组测序共检测到已知基因53853个,未知基因580个3.获得GSN-SMMC7721及其亲本SMMC7721两个细胞株共495个差异基因表达数据,其中上调基因277个,下调基因218个。差异基因的聚类分析表明肝癌细胞株的基因表达与正常肝细胞株存在差异。4.GO分类的研究结果提示GSN抑制凋亡相关的生物学过程,这些被抑制的凋亡相关子类分别是apoptoticprocess,DNAdamageresponse,signaltransductionbyp53classmediatorresultingininductionofapoptosis,JNKcascade,cellularresponsetointerleukin-3,andcysteine-typeendopeptidaseactivatoractivityinvolvedinapoptoticprocess。这些子类含13个凋亡相关基因,其中12个表达下调,1个上调,且主要表现为正向促凋亡基因被抑制,提示GSN的抑凋亡作用。被GSN抑制的凋亡基因分别是PSME2,PTK2B,RRM2B,FOS,JUN,ITGB1,MAP2K7,MAP3K4,MAP3K12和Rac1,参与antigenprocessingandpresentation,naturalkillercellmediatedcytotoxicity,p53signalingpathway,pathwaysincancer,Jak-STATsignalingpathway和MAPKsignalingpathway等6个凋亡相关通路。5.在受GSN影响的6个通路中,除antigenprocessingandpresentation通路外,其余5个生物学通路均存在交联部分,这些通路最终影响凋亡的终末分子分别是Bcl-2、cytochromeC和caspase3.结论：1.RNA-seq技术是一个研究基因表达调控的强有力的工具,通量大,分辨率高,理论上能够检测到所有表达的基因。2.GSN可能是肝癌细胞凋亡的抑制因子,并通过影响naturalkillercellmediatedcytotoxicity,p53signalingpathway,pathwaysincancer,Jak-STATsignalingpathway和MAPKsignalingpathway生物学通路抑制肝癌细胞凋亡。3.Bcl-2、cytochromeC(?)caspase3可能在MAPK-JNK信号通路抑制肝癌细胞凋亡的生物学过程中发挥重要作用。4.转录组学研究结果为下一步研究GSN的功能提供了有价值的线索。第三部分GSN过表达抑制肝癌细胞凋亡目的：利用凋亡检测技术探讨GSN与肝癌细胞凋亡的关系。方法：1.以GSN沉默／过表达稳转肝癌细胞和其空载对照细胞GSN-SMMC7721、NC1-SMMC7721、GSNshRNA-SMMC7721和NC2-SMMC7721为研究对象，采用流式细胞技术检测细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率。2.采用凋亡因子In-cellWB技术检测凋亡相关因子caspase3、bcl-2、cytochromeC的表达水平，分析与GSN过表达抑制肝癌细胞凋亡的关系。3.采用透射电镜观察GSN沉默/过表达稳转肝癌细胞株内存在的凋亡形态。结果：1.流式细胞技术的检测结果表明，GSN过表达肝癌细胞GSN-SMMC7721的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率分别为0.72±0.11、3.48±0.25和4.20±0.18；GSN沉默肝癌细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率分别为9.97±1.01、5.44±0.98和15.41±1.26。GSN过表达肝癌细胞的晚期凋亡率和总凋亡率低于其空载对照细胞NC1-SMMC7721（P≤0.05）；GSN沉默肝癌细胞的早期凋亡率和总凋亡率则高于其空载对照细胞NC2-SMMC7721（P≤0.05）。2.In-cellWB检测凋亡相关因子的结果表明，与对照NC1-SMMC7721相比，GSN-SMMC7721细胞中caspase3蛋白表达下调至0.625±0.133(P=0.023)，bcl-2蛋白上调至4.138±0.857（P=0.004）；与对照NC2-SMMC7721相比，GSNshRNA-SMMC7721细胞中caspase3蛋白上调至1.908±0.257(P=0.041)，bcl-2蛋白下调至0.411±0.122（P=0.018）。而GSN表达水平对cytochromeC的表达则没有影响。3.透射电镜观察到的凋亡细胞，核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，并可见凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。在GSNshRNA-SMMC7721细胞中，透射电镜可观察到诸多凋亡相关形态，如凋亡小体、自噬、早期凋亡、晚期凋亡和胀亡等。结论:1.流式技术和电镜观察证实GSN在肝癌细胞中过表达可明显抑制肿瘤细胞凋亡。2.蛋白表达水平的检测证实，GSN抑制肝癌细胞凋亡的分子机制是通过刺激凋亡抑制因子bcl-2表达,并抑制促凋亡因子caspase3表达,bcl-2和caspase3是介导GSN抑制肝癌细胞凋亡的关键分子。第四部分GSN表达水平增高促进肝癌细胞浸润转移目的：GSN对多种恶性肿瘤的浸润转移具有重要作用，但其在肝癌中的表达水平以及与肝癌转移的关系鲜有报道，本研究结合临床对此进行探讨。方法：1.采用免疫组化检测69例肝癌和癌旁组织中GSN的表达并分析其与临床指标的相关性。2.利用GSN沉默/过表达稳转肝癌细胞和其空载对照细胞GSN-SMMC7721、NC1-SMMC7721、GSNshRNA-SMMC7721和NC2-SMMC772,通过体外划痕、transwell迁移和侵袭实验、MMPs活性检测，探讨GSN对肝癌细胞浸润转移的影响。3.采用FLAG和HA双标记两次TAP-IP技术筛选与GSN相互作用蛋白。提取GSN过表达稳转肝癌细胞蛋白，加入Flag柱，3xFLAG多肽洗脱，洗脱产物与HA柱4℃悬浮孵育后，3×HA多肽洗脱，产物浓缩定量。经超滤，变性，还原，烷基化，溶液内酶解后进行MALDI-TOF-MS/MS质谱仪检测和搜库鉴定相互作用蛋白。参数如下：优化分子质量范围为800-4000，一级质谱（MS）激光激发1250次，在阳离子模式下用反射模式进行检测，二级MS/MS激光激发2500次。质谱分析数据用ProteinPilot2.0对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白，报告置信度在95%以上的蛋白质，选择P≤0.05的结果进行报告。对有一个以上高置信度（≥99%）唯一多肽匹配的蛋白不再进行人工确认，对不含高置信度（≥99%）唯一多肽匹配的蛋白，用手工方法对MS/MS图谱碎片离子进行检查确认。4.体外pulldown实验分析GSN与相互作用蛋白MMP14的可能结合位点。首先利用生物信息学预测，两蛋白相互作用位点可能集中在MMP14的两个区域catalyticdomain(Tyr89-Gly261)和hemopexin-likedomain（Pro293-Cys485)；构建Hisbind填料柱，将带Hisbind标签的上述两个结构域片段结合到Hisbind柱上，提取GSN过表达稳转细胞蛋白，加入Hisbind柱中，与柱上的MMP14结构域相互反应，洗脱结合物，超滤浓缩定量，还原烷基化，溶液内酶解，C18柱脱盐浓缩后进行MALDI-TOF-MS/MS质谱仪检测和搜库鉴定，参数同3。5.RT-PCR、In-cellWB等实验对GSN相互作用蛋白进行验证，探讨GSN过表达影响肝癌细胞转移的可能机制。结果：1.从69例肝癌和癌旁组织样本中分析GSN的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和数量、门脉癌栓和有无转移、复发等的关系，结果表明，GSN在癌旁样本中的表达阳性率为100.0%（69/69），高于肝癌样本的72.5%(50/69)（P≤0.05）；在发生门脉癌栓和肝外转移的肝癌样本中，GSN表达阳性率分别为80%（8/10）和88.9%(16/18)，高于无门脉癌栓和肝外转移样本的50.8%（30/59）和43.1%(22/51)（P≤0.05）。而GSN的表达水平在患者年龄、性别、肿瘤大小和数量、有无复发等因素中无明显不同。2.96小时后观察划痕愈合的情况，SMMC-7721的愈合率(%)达86.0±6.0，高于NC1-SMMC7721的51.7±3.0（P=0.011）；而GSNShRNA-SMMC7721的划痕愈合率与其对照组相比，则没有差异；迁移和侵袭实验表明，GSN-SMMC7721中发生迁移和侵袭的平均细胞数目约为278个，而GSNshRNA-SMMC7721、NC1-SMMC7721及NC2-SMMC7721中发生迁移和侵袭的平均细胞数仅为72、143和138。GSN-SMMC7721中迁移和侵袭的平均细胞数目多于对照细胞系NC1-SMMC7721（P=0.000）；采用明胶酶谱法检测GSN稳定转染肝癌细胞中的MMPs活性，结果表明，GSN-SMMC7721中MMP2的活性为35.7±1.3，高于对照组的13.8±1.7（P=0.023）。3.TAP-IP鉴定到与GSN相互作用的蛋白共13个，其中MMTM和MMP14是已知的转移相关蛋白，质谱得分分别为74和62分。4.体外pulldown实验显示与HisbindMMP14hemopexin-likedomain（Pro293-Cys485)相互作用的蛋白有2个，其中一个蛋白即为GSN，质谱鉴定的得分为98分，证实GSN结合在MMP14hemopexin-likedomain（Pro293-Cys485)。5.采用RT-PCR、Ic-cellWB分析MMP14和MMP2在GSN-SMMC7721、NC1-SMMC7721细胞中的表达，结果表明，MMP2和MMP14的mRNA水平在GSN-SMMC7721中分别上调至对照细胞NC1-SMMC7721的5.257±0.618和3.485±0.533倍（P≤0.05）；MMP2和MMP14的蛋白水平在GSN-SMMC7721中则分别上调至对照细胞NC1-SMMC7721的3.625±0.422和2.933±0.312倍（P≤0.05）。结论：1.在转移肝癌病人肝癌组织中GSN表达增高。2.GSN过表达肝癌细胞的迁移和侵袭能力提高，细胞内基质金属蛋白酶MMP2活性增加。3.GSN影响肝癌细胞转移的机制是通过与MMP14的相互作用，使得MMP2活性增高而促进癌细胞浸润转移。
【作者】周怡；
【导师】何敏；
【作者基本信息】广西医科大学，流行病与卫生统计学，2014，博士
【关键词】HCC；GSN；转录组测序；凋亡抑制因子；移标志物；

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